Proteomica Funzionale, Metabolomica e Studio delle Reti Molecolari
UNITÁ DI RICERCA E FACILITY
L’attività di ricerca del Laboratorio è incentrata sulla Proteomica e sulla Metabolomica, discipline della biologia molecolare dedicate allo studio del proteoma e del metaboloma. L’obiettivo è identificare lo spettro di proteine e metaboliti espressi in condizioni fisiologiche e monitorarne le variazioni in diversi stati patologici o in seguito a trattamenti.
Lo scopo ultimo è comprendere i meccanismi alla base dell’insorgenza delle malattie cardiovascolari, delinearne le alterazioni proteiche e metabolomiche, e individuare bersagli molecolari per potenziali interventi farmacologici.
Le applicazioni di proteomica e metabolomica sono ampie: spaziano dallo sviluppo di nuovi biomarcatori allo studio della funzione genica. Per affrontare tali sfide, l’attività del Laboratorio si fonda su un approccio interdisciplinare che integra competenze avanzate di spettrometria di massa, biologia cellulare e molecolare e farmacologia.
Il Laboratorio è attivamente inserito nella comunità scientifica a livello nazionale e internazionale. In particolare:
- a livello mondiale, partecipa al progetto The Mitochondrial Italian Human Proteome Project Initiative (mt-HPP);
- a livello europeo, rappresenta l’unico Centro di Proteomica clinica coinvolto nel progetto MASSTRPLAN (H2020-MSCA-ITN-2015) e partecipa al consorzio CA19105 - Pan-European Network in Lipidomics and EpiLipidomics (EpiLipidNET);
- a livello nazionale, contribuisce al progetto della Rete Cardiologica Italiana volto all’applicazione della spettrometria di massa per la validazione di nuovi marcatori di patologie cardiovascolari.
Progetti
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Proteomica delle lipoproteine umane: identificazione di nuovi mediatori del processo aterotrombotico
L’aterotrombosi rappresenta la principale causa di eventi cardiovascolari, e le lipoproteine aterogene svolgono un ruolo cruciale nei processi patogenetici che ne sono alla base. Le LDL modificate, ad esempio, alterano le proprietà antitrombotiche dell’endotelio vascolare riducendo la biodisponibilità di ossido nitrico e attivando vie di segnalazione pro-infiammatorie. Inoltre, tali particelle influenzano in maniera significativa le funzioni e le interazioni delle cellule presenti nelle lesioni aterosclerotiche, siano esse derivate dalla circolazione o residenti nella parete vascolare.
Sulla base di queste osservazioni, la letteratura scientifica riconosce da tempo l’importanza di ridurre i livelli di colesterolo veicolato dalle lipoproteine aterogene per abbassare il rischio cardiovascolare. Tuttavia, le terapie attualmente disponibili non risultano pienamente efficaci in tutti i pazienti trattati (Libby P., JACC 2005; 46:1225-8; Catapano A.L., Atherosclerosis 2014; 237:319-35).
I meccanismi molecolari che collegano i livelli plasmatici di lipoproteine aterogene al rischio cardiovascolare non sono ancora stati completamente chiariti. È noto, inoltre, che modificazioni del corredo proteico delle lipoproteine possano comprometterne la funzionalità e contribuire allo sviluppo della patologia cardiovascolare. La conoscenza delle componenti proteiche e del loro ruolo fisiologico rimane, ad oggi, parziale.
Negli ultimi anni, l’applicazione delle tecniche “omiche” — in particolare la proteomica — ha ampliato in modo significativo queste conoscenze, consentendo l’identificazione di proteine finora non associate alle LDL. Tra queste, il nostro gruppo ha individuato per la prima volta una proteina fino ad ora non descritta come costituente della struttura delle lipoproteine umane, il cui ruolo biologico resta tuttora sconosciuto.
L’obiettivo del presente studio è analizzare la funzione di questa nuova proteina nell’eziopatogenesi del processo aterotrombotico, con l’intento di chiarirne le implicazioni biochimiche e cliniche. In particolare, si valuterà se la sua attività possa contribuire ai meccanismi patogenetici o, al contrario, se la sua inibizione possa rappresentare un potenziale bersaglio farmacologico per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e preventive contro le malattie cardiovascolari.
Identificazione di biomolecole ossidate mediante spettrometria di massa come marcatori diagnostici di patologie cardiovascolari
La conoscenza attuale sull’origine, la tipologia e la quantità di biomolecole ossidate (lipidi e proteine) circolanti nel plasma di pazienti affetti da patologie cardiovascolari, e in particolare da scompenso cardiaco, rimane ancora limitata. Approfondire l’analisi di tali molecole è cruciale per acquisire nuove informazioni sui meccanismi eziopatogenetici e sulla progressione della malattia.
Numerosi studi in vitro e in vivo supportano l’ipotesi che lo scompenso cardiaco sia caratterizzato da un marcato stress ossidativo sia a livello cardiaco sia sistemico, e che il danno ossidativo cronico contribuisca all’indebolimento della funzione miocardica e alla progressione clinica della patologia attraverso molteplici meccanismi.
In particolare:
· stimoli neuro-ormonali possono indurre ipertrofia dei miociti tramite l’attivazione, mediata da specie reattive dell’ossigeno (ROS), di componenti della cascata di trasduzione del segnale;
· la funzione contrattile dei miociti risulta alterata da un’eccessiva produzione di ROS, che interferisce con il ciclo del calcio, modifica la risposta dei microfilamenti al calcio e compromette il metabolismo energetico cellulare;
· lo stress ossidativo cronico favorisce inoltre il rimodellamento tissutale attraverso l’induzione di processi fibrotici.
La possibilità di monitorare i profili di biomolecole ossidate offre quindi una prospettiva promettente per l’identificazione di nuovi marcatori diagnostici e prognostici nello scompenso cardiaco.
Validazione di marcatori di danno della membrana alveolo-capillare nello scompenso cardiaco: sviluppo di una metodologia quantitativa basata sulla spettrometria di massa
Negli ultimi anni la spettrometria di massa si è affermata come una delle tecnologie più promettenti e affidabili in ambito di ricerca clinica, grazie alla sua capacità di identificare e quantificare biomolecole con elevata sensibilità e accuratezza, rendendola sempre più rilevante anche in contesto diagnostico.
Tra le metodiche più avanzate, la selected reaction monitoring (SRM) — o multiple reaction monitoring (MRM), quando vengono monitorati ioni multipli all’interno della stessa analisi — rappresenta una soluzione particolarmente valida per la quantificazione accurata di proteine o peptidi a bassa concentrazione e delle loro modificazioni post-traduzionali o chimiche in matrici proteiche complesse (fluidi biologici o estratti tissutali). Rispetto ai saggi immunologici tradizionali, che richiedono tempi lunghi di sviluppo e costi elevati, l’approccio SRM/MRM offre infatti rapidità, elevata sensibilità (fino al livello degli attomoli) e alta selettività, in quanto si concentra su un numero limitato di peptidi target invece di eseguire una scansione globale dell’intero peptidoma. Tale tecnica è stata inoltre ampiamente utilizzata per lo studio di isoforme proteiche e modificazioni post-traduzionali, quali fosforilazione, glicosilazione e acetilazione, fondamentali nel modulare i processi biologici sia in condizioni fisiologiche sia patologiche, determinando la diversità funzionale del proteoma umano.
Nel corso delle nostre ricerche abbiamo osservato che i livelli di una isoforma immatura della Surfactant Protein B (SP-B) risultano significativamente aumentati nei pazienti con scompenso cardiaco. Questo fenomeno sembra associarsi all’elevata pressione microvascolare polmonare, che compromette l’integrità della barriera alveolo-capillare e favorisce il rilascio di SP-B nel circolo ematico. È stato inoltre dimostrato che i livelli plasmatici di SP-B correlano con la disfunzione della membrana alveolo-capillare (in particolare con l’alterazione della diffusione dei gas), supportando il potenziale ruolo di questa proteina come biomarcatore plasmatico specifico di danno polmonare.
Attualmente, tuttavia, non esistono saggi quantitativi standardizzati e applicabili su larga scala per la determinazione dei livelli plasmatici delle diverse isoforme di SP-B. Il presente progetto, che vede il coinvolgimento di gruppi di ricerca italiani aderenti alla Rete Cardiovascolare, si propone quindi di sviluppare una metodologia quantitativa basata sulla spettrometria di massa per la misurazione delle isoforme di SP-B nel plasma. L’implementazione di tale approccio consentirebbe di monitorare con precisione i livelli circolanti di SP-B, fornendo un nuovo e affidabile marcatore di danno polmonare associato a disfunzione della membrana alveolo-capillare nello scompenso cardiaco.
