Biologia vascolare e medicina rigenerativa

Responsabile

Giulio Pompilio
Pompilio

L’attività di ricerca applicata ha come obiettivo generale lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per il trattamento di patologie cardiovascolari per cui le terapie convenzionali sono insufficienti o non disponibili.

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Le condizioni cliniche di interesse sono l’ischemia refrattaria cardiaca e periferica e patologie cardiovascolari di origine genetica prive di terapie eziologiche, come la Sindrome di Marfan. Le attività si articolano in progetti di ricerca che hanno come denominatore comune il paziente, quale fonte di materiale biologico e quale destinatario finale delle attività di ricerca traslazionale.

In particolare, l’Unità è focalizzata su:

  1. l’utilizzo di modelli cellulari umani derivati da cellule staminali e/o progenitrici per studi meccanicistici e terapeutici;
  2. lo sviluppo e l’implementazione di prodotti biologici avanzati di terapia rigenerativa cardiovascolare.

L’Unità si avvale inoltre di:

  • una sezione specificamente dedicata alla ricerca clinica con particolare riferimento alle terapie biologiche avanzate (prodotti di terapia cellulare e genica) cardiache e periferiche, impegnata in studi clinici controllati secondo le regole della Good Clinical Practice;
  • un laboratorio di chirurgia sperimentale per studi traslazionali su modelli murini di patologia miocardica e periferica.

Progetti

  • Studio di patologie di origine genetica con modelli cellulari umani

    Studio di meccanismi eziopatologici di cardiomiopatie di origine genetica con cellule staminali pluripotenti indotte

    La scoperta delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha rivoluzionato la ricerca basata sulla medicina personalizzata. Questa tecnologia permette di riprogrammare cellule altamente differenziate (ad esempio fibroblasti) in cellule staminali pluripotenti che hanno il potenziale di differenziarsi in molteplici linee cellulari. È da notare che le iPSC sono paziente-specifiche e costituiscono un’enorme risorsa per la medicina personalizzata che potrebbe essere impiegata per gestire, trattare e potenzialmente curare molti tipi di malattia.

    L’Unità di Biologia Vascolare e Medicina Rigenerativa ha ampie competenze nella generazione di iPSC e cardiomiociti derivati da iPSC (CM-d-iPSC) ottenute da pazienti con cardiomiopatie su base genetica (per esempio, Distrofia Muscolare di Duchenne e Becker, vedi fig.1). L’obiettivo è quello di mettere a punto analisi avanzate con lo scopo di:

    1. migliorare il grado di maturità dei CM-d-iPSC per offrire un modello di malattia che ricapitoli la patologia nel cuore umano;
    2. analizzare i meccanismi molecolari che sottendono a cardiomiopatie con eziologia genetica;
    3. sviluppare saggi di tipo ‘high-throughput’ in CM-d-iPSC per identificare nuovi farmaci su base personalizzata.

    Tale progetto di ricerca ha un valore altamente traslazionale. Esso, infatti, ha come obiettivo principale il miglioramento della cura di pazienti con patologie cardiovascolari attraverso la traslazione di terapie sempre più mirate ed efficaci calibrate sul paziente.

    Figura 1. Step 1) Generazione iPSC. I fibroblasti dermici umani sono stati trasfettati con i fattori di riprogrammazione (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c Myc) e le colonie IPSC sono emerse dopo 17 giorni dalla trasfezione. Step 2) Caratterizzazione delle iPSC. Le iPSCs sono risultate positive per la fosfatasi alcalina ed hanno presentato un’elevata espressione delle proteine di pluripotenza Oct3/4 e SSEA4. Step 3) Differenziamento in cardiomiociti. Le iPCS sono state differenziate in CMs attraverso la modulazione temporale del signalling di Wnt (come descritto da Lian et al. 2013 Nature Protocols, 8: 162-175). L’esito positivo del differenziamento è stato dimostrato mediante l’analisi dell'espressione del marcatore cardiomiocitario, la troponina cardiaca di tipo 2 (cTnT 2).

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    Figura 1

    Studio di fattori cellulari e molecolari che contribuiscono alla patogenesi della cardiomiopatia aritmogena

    La cardiomiopatia aritmogena è la causa più diffusa, soprattutto in Italia, di morte improvvisa di origine cardiaca tra i giovani atleti. E’ causata da una mutazione nel DNA, che porta, con modalità fino ad oggi non note, alla comparsa di grasso nel cuore, impedendone la corretta funzione e provocando cortocircuiti elettrici, che lo portano a contrarsi con un ritmo frenetico e disordinato tanto da causarne spesso l’arresto.

    Questo progetto ha contribuito a fare chiarezza sul fenomeno della trasformazione cellulare in adipociti, le cellule del grasso che si formano nel cuore dei pazienti. In particolare è stata individuata la componente cellulare responsabile del fenomeno e sono stati chiariti i meccanismi a esso sottesi. I risultati del primo studio evidenziano come le cellule mesenchimali dello stroma cardiaco, cellule di sostegno con compiti di scambio e di interconnessione con le cellule contrattili, siano, in questi pazienti, più propense all’accumulo di grasso e al differenziamento in adipociti. Le cellule stromali cardiache costituiscono quindi un modello ottimale di malattia.

    La stretta collaborazione con i clinici dell’Unità di Elettrofisiologia permette di espandere il progetto, che, partendo da materiale bioptico prelevato dai pazienti, ha come scopo quello di comprendere meccanismi cellulari e molecolari della malattia, in modo da individuare bersagli terapeutici per lo sviluppo di nuovi farmaci. In particolare, l’obiettivo principale consiste nell’individuare i cofattori di patogenesi che spieghino perché portatori della stessa mutazione genetica abbiano espressione clinica diversa della cardiomiopatia aritmogena, e i fattori che innescano i processi degenerativi descritti. Inoltre, viene studiato il contributo delle dislipidemie sul fenotipo e il ruolo del sistema nervoso nello scatenare la patologia.

    Figura 2. Le cellule in attivo differenziamento in adipociti (PLIN1+) in cuori espiantati dei pazienti mostrano marcatori mesenchimali (CD29+ e CD105+). Da: Sommariva et al., EHJ, 2015.

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    Figura 2

    Figura 3. Le cellule mesenchimali stromali cardiache ottenute da biopsie di pazienti con cardiomiopatia aritmogena sono più predisposte all’accumulo lipidico (in rosso) rispetto a cellule ottenute da controlli. Da: Sommariva et al., EHJ, 2015.

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    Figura 3


    Sviluppo di prodotti di terapia rigenerativa dell’ischemia miocardica e periferica

    Ruolo della Ciclofillina A nel danno tissutale ischemico e nella rigenerazione

    L’ischemia critica degli arti inferiori (CLI) è una patologia molto diffusa; colpisce circa tre milioni di individui in Europa Occidentale e la sua prevalenza sta aumentando in tutto il mondo. Nonostante le moderne applicazioni chirurgiche e terapeutiche abbiano aumentato la percentuale di salvataggio degli arti affetti da CLI, l’amputazione resta sempre l’evento più probabile. Quindi l’identificazione di nuove strategie e targets terapeutici rappresenta una reale emergenza clinica.

    Poiché la CLI è caratterizzata da un’inadeguata vascolarizzazione tissutale, nuove linee di ricerca si sono rivolte all’impiego di fattori che promuovano la formazione di nuovi vasi al fine di incrementare il flusso ematico nei tessuti ischemici. Nel laboratorio è stata identificata una proteina che promuove la neoangiogenesi, la Ciclofillina A (CyPA), enzima afferente alla famiglia delle peptidil-prolil cis-trans isomerasi. Studi in corso sono volti alla completa caratterizzazione degli effetti pro-angiogenici della CyPA in un modello pre-clinico di “hind-limb ischemia” nel topo. Tali studi offriranno la base per un’eventuale traslazione clinica della CyPA nel trattamento dell’ischemia periferica.

    Figura 4. La CyPA aumenta la perfusione dell’arto ischemico. (A) Immagini rappresentative a 3 giorni dall’hind-limb ischemia: scala di grigi dell’area esaminata (pannelli in alto) basata sulla registrazione totale della luce riflessa e mappa di perfusione (pannelli in basso) caratterizzata da una scala cromatica che va dal blu al rosso, che rappresentano rispettivamente, una perfusione ematica tissutale progressivamente più intensa. (B) Analisi del segnale di perfusione tradotto in valori numerici e graficamente a tempi (T) successivi alla “hind-limb ischemia”.

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    Figura 4

    Ruolo dei progenitori cardiaci umani (hCPCs) nell’omeostasi miocardica e loro utilizzo come prodotti di terapia biologica avanzata. Profilo clinico e farmaci

    La scoperta di progenitori residenti nel cuore adulto ha rivoluzionato il dogma del cuore come organo incapace di autorinnovamento. È stato dimostrata (Gambini E. et al. Cardiovasc Res 2011) la presenza di una popolazione di cellule progenitrici residenti cardiache (hCPCs) in grado di differenziare in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce in-vitro e in-vivo, contribuendo all’omeostasi tissutale e alla rigenerazione cardiaca.

    Per studiare il ruolo dei hCPCs nell’omeostasi cardiaca fisiologica e patologica nel cuore umano, l’Unità ha interesse nella correlazione del profilo clinico e terapeutico dei pazienti cardiopatici con le caratteristiche biologiche di hCPCs (Gambini et al. Transl Res 2012). I risultati ottenuti hanno mostrato che alcune variabili cliniche, i fattori di rischio e la terapia farmacologica del paziente hanno un impatto di diversa entità sul numero e la funzione delle hCPCs residenti.

    Gli studi in corso sono volti a valutare l'influenza di alcuni farmaci per uso cardiovascolare sulla capacità di proliferazione, differenziamento e risposta allo stress ossidativo di tali cellule. Lo scopo è quello di individuare molecole che possiedono un effetto benefico sui progenitori cardiaci e di sviluppare nuovi protocolli di pre-condizionamento ex-vivo ed in-vivo per migliorare il loro potenziale terapeutico. È inoltre di interesse per il laboratorio lo studio degli effetti di condizioni patologiche croniche (come la fibrillazione atriale) sulle caratteristiche biologiche delle hCPCs.

    Figura 5. Le cellule progenitrici cardiache umane in opportune condizioni di coltura sono in grado di differenziare (A) formando tubi su una matrice sintetica (tipici del differenziamento endoteliale), (B) esprimendo α-SMA, marcatore tipico delle cellule muscolari lisce e (C) esprimendo ANP, T-Myo e CX-43, marcatori tipici cardiomiocitari. Da: Gambini et al., Car Res, 2011.

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    Figura 5

    Tabella. Mediante una analisi di regressione lineare con metodo di selezione stepwise è stata individuata l’associazione tra variabili cliniche e demografiche dei pazienti e le caratteristiche biologiche di cellule hCPCs. Dall’analisi è emerso come la presenza di fibrillazione atriale sia significativamente associata ad una diminuita capacità proliferativa delle hCPCs, mentre la stessa capacità di amplificazione sia positivamente correlata all’assunzione di farmaci quali le statine. Da: Gambini et al., Trals Res, 2012.

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    Tabella

    Studi pre-clinici di prodotti di terapia cellulare cardiaca e traslazione clinica GMP-grade

    La medicina rigenerativa basata sull’impiego di cellule staminali/progenitrici di origine cardiaca ha fornito approcci terapeutici alternativi nel trattamento delle patologie cardiovascolari. Tuttavia, studi preclinici hanno dimostrato che le hCPCs presentano una limitata capacità di sopravvivenza, proliferazione e integrazione nel cuore danneggiato.

    Lo sviluppo di tecniche che migliorino la sopravvivenza delle hCPCs trapiantate è fondamentale per ricostituire in modo adeguato il pool di cellule staminali residenti e per massimizzare il loro potenziale rigenerativo. Di conseguenza, l’interesse è quello di testare l’efficacia terapeutica delle hCPCs studiate finora nel laboratorio in modelli preclinici di ischemia acuta del miocardio per identificare le sottopopolazioni con migliore capacità rigenerativa. Ci si avvale, per questi studi, della vasta esperienza dell’Unità nei modelli murini di patologie cardiache e in tecnologie avanzate di analisi funzionale cardiaca, come l’ecocardiografia 2-D e le misurazioni emodinamiche invasive.

    Inoltre, nell’ottica di poter utilizzare in clinica cellule hCPCs, è in fase avanzata di implementazione un protocollo per la loro produzione, in accordo con le regole della Good Manifacturing Practice (GMP), come definito dall’Istituto Superiore di Sanità (ISS) per la sperimentazione clinica dei prodotti di terapia cellulare (PTC).

    Figura 6. Analisi ecocardiografica 2-D della funzione e dei volumi del ventricolo sinistro prima e dopo induzione di insufficienza cardiaca con farmaci cardiotossici.

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    Figura 6


    Terapia cellulare della cardiomiopatia ischemica refrattaria


    Studio clinico di fase I di iniezione endocavitaria intramiocardica di cellule CD133+ derivate da midollo per il trattamento della cardiomiopatia ischemica refrattaria: RECARDIO trial

    Lo studio si basa sull’utilizzo delle cellule progenitrici endoteliali, prelevate nel paziente dal sangue midollare e inoculate nel cuore per via percutanea allo scopo di creare nuovi vasi (angiogenesi terapeutica) all’interno di regioni cardiache colpite da ischemia. Con l’innesto di tali cellule, opportunamente preparate, nel tessuto miocardico, ci si pone l’obiettivo di restituire alla porzione di muscolo cardiaco sofferente per mancanza di ossigeno una quantità di sangue sufficiente alle richieste metaboliche (neoangiogenesi terapeutica).

    Come da evidenze sperimentali del laboratorio, tali cellule (chiamate CD133+) hanno la potenzialità di dare luogo a nuovi vasi sanguigni (by-pass naturali). Si tratta di una nuova possibile terapia che viene proposta a pazienti che non sono più curabili con le tecniche convenzionali di rivascolarizzazione (angioplastica con stent o by-pass).

    Il giorno precedente l’intervento, i pazienti vengono sottoposti, dopo somministrazione di anestesia spinale, all’espianto di circa 250ml di sangue midollare dalla cresta iliaca. Il sangue midollare così aspirato viene immediatamente trasferito presso il Laboratorio GMP di Terapia Cellulare “Stefano Verri” dell’AO San Gerardo di Monza, dove personale qualificato ed autorizzato effettua le manipolazioni del materiale biologico con selezione di cellule staminali CD133+. L’intervento di iniezione cellulare viene effettuato il giorno seguente. La fase di osservazione clinica e strumentale si protrae per un periodo di 1 anno dall’intervento.

    Figura 7. RECARDIO trial: A) prelievo di midollo dalla cresta iliaca, B) Selezione immunomagnetica di cellule CD133+ presso l’Officina di produzione cellulare; C) preparazione del paziente il giorno seguente presso i laboratori intervenzionali; D) inoculazione percutanea di cellule CD133+ nelle zone ischemiche del ventricolo sinistro attraverso cateteri di iniezione dedicati.

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    Figura 7

    Studio in doppio cieco, randomizzato, con controllo sham, a gruppi paralleli di sicurezza ed efficacia di precursori mesenchimali allogenici (rexlemestrocel-L) in pazienti con insufficienza cardiaca cronica dovuta a disfunzione sistolica ventricolare sinistra ad eziologia ischemica e non ischemica: DREAM HF-1

    Lo studio vuole verificare se la somministrazione transendocardica NOGA-guidata di precursori mesenchimali allogenici (rexlemestrocel-L) in pazienti con disfunzione sistolica ventricolare sinistra ad eziologia ischemica e non ischemica sia in grado di migliorare significativamente l’outcome clinico in termini di eventi cardiovascolari maggiori quali morte cardiaca, impianto di dispositivi di assistenza ventricolare, trapianto cardiaco o impianto di cuore artificiale (MACE).

    La popolazione inclusa nello studio verrà sottoposta a visite di follow-up a 6, 12 e 24 mesi dalla somministrazione del trattamento sperimentale con rexlemestrocel-L per la raccolta dei MACE. Il DREAM-HF è uno studio condotto in oltre 200 cardiologie di Canada, Stati Uniti e Europa e vede il prof. Giulio Pompilio quale coordinatore nazionale della Sperimentazione.


    Terapia cellulare dell’infarto STEMI

    Sperimentazione clinica prospettica, in doppio cieco, randomizzata, controllata con placebo, dell’infusione intracoronarica dei precursori mesenchimali immunoselezionati Stro3 derivati da midollo osseo, nel trattamento di pazienti colpiti da STEMI anteriore: AMICI trial

    Lo studio AMICI vuole valutare l’efficacia dell’infusione intracoronarica di precursori mesenchimali immunoselezionati Stro3 in pazienti con un primo episodio di STEMI anteriore sottoposti entro 12 ore dall’inizio dei sintomi ad angioplastica primaria efficace. I pazienti inclusi nello studio verranno sottoposti a risonanza magnetica cardiaca al basale e a 6 mesi per quantificare l’evoluzione verso il rimodellamento ventricolare sfavorevole nel gruppo trattati e nel gruppo controlli. Lo studio è attivo in 45 centri a livello internazionale.

    STEM-AMI OUTCOME Trial – Sottostudio Risonanza Magnetica Cardiaca (RM)

    Lo STEM-AMI OUTCOME è uno studio nazionale, multicentrico, in aperto, di fase III, condotto su 1530 pazienti con STEMI sottoposti ad angioplastica primaria efficace e con evidenza di disfunzione ventricolare sinistra randomizzati 1:1 a ricevere G-CSF (Granulocyte-colony-stimulating factor) due volte al giorno per 6 giorni o terapia standard.

    I pazienti arruolati vengono valutati a 1, 6, 12 e 24 mesi per la raccolta dei MACE (morte, re-infarto, ospedalizzazione per scompenso) e dei dati di sicurezza del farmaco.
    Nell’ambito di tale studio, il laboratorio ha promosso e coordinato il sottostudio RM che prevede in settima giornata e a 6 mesi dall’infarto l’esecuzione di una risonanza magnetica cardiaca. Questa metodica permetterà di identificare, in un gruppo di 120 pazienti, l’eventuale miglioramento della funzione sistolica ventricolare sinistra, la riduzione dell’area infartuale e il rimodellamento favorevole nel gruppo di pazienti trattati con G-CSF.


    Terapia rigenerativa dell’arto inferiore

    L’unità ha uno specifico interesse nello sviluppo e nella sperimentazione di prodotti biologici nell’ischemia critica degli arti inferiori e nella terapia delle ulcere croniche. A livello clinico, vengono condotti studi controllati di fase I-III. A livello preclinico, l’Unità ha interesse nella ricerca e sviluppo di prodotti terapeutici biologici.

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Staff

  • Patrizia Nigro, Staff Scientist
    Elisa Gambini, Technologist
    Alessandro Scopece, Technologist
    Giuseppina Milano, Postdoctoral Fellow
    Gabriella Spaltro, Postdoctoral Fellow
    Elena Sommariva, Postdoctoral Fellow
    Erica Rurali, Postdoctoral Fellow
    Aoife Gowran, Research Fellow
    Gianluca Perrucci, Research Fellow

    Clinical research staff: Beatrice Bassetti, Technologist